Bluttests

Die Bluttests dienen zur allgemeinen Kontrolle der Diätführung, sowie beim Neugeborenen Screening zur Entdeckung der PKU Babies. Um durch die Beschreibungen der verschiedenen Testarten, welche in der Schweiz vertreten sind, so viele Informationen wie möglich weiterzugeben, besuchte ich die Stoffwechsel Laboratorien der Kinderspitäler Zürich und Basel. Es hat mir auf der einen Seite sehr viel Spass gemacht die beiden Testarten genauer kennen zu lernen. Andererseits kamen sehr bald grosse Zweifel bezüglich der Genauigkeit des Testes, mit welchem ich bisher meinen Blut-Wert kontrolliert habe.

Neugeborenen Screening

Für die Durchführung eines Neugeborenen Screening einer angeborenen Krankheit gibt es sicherlich Grundbedingungen. Hier sind die wichtigsten aufgelistet:

1. Der Test muss genau genug sein, um in den ersten Lebtagen mit Sicherheit eine angeborene Krankheit zu erkennen. Es darf nicht vorkommen, dass ein Test als negativ ausfällt, obwohl er positiv wäre.
2. Es darf vorkommen, dass ein Test fälschlicherweise positiv herauskommt. Dies sollte jedoch nicht häufiger als in 0.2-0.3% der Fälle vorkommen, um die psychische Belastung der Eltern zu vermeiden.
3. Der Test darf keinesfalls teuer und muss einfach sein. Er soll ohne grosse Probennahme durchgeführt werden können.
4. Es ist nur sinnvoll einen Test zu machen, wenn es sich um eine nicht allzu seltene Krankheit handelt.
5. Für die diagnostizierte Krankheit muss eine wirkungsvolle Therapie bekannt sein.
6. Es müssen Unterlagen zur Bestätigung des Testresultates vorhanden sein.
7. In Deutschland wird jeder eingegangene Test rückgemeldet, um Verluste z.B. bei der Post zu entdecken.

Der Test des Neugeborenen Screenings, auf Stoffwechselstörungen, ist in der Schweiz der Guthrie Test. Das gesamtschweizerische Neugeborenen Screening verläuft über das Stoffwechsellabor des Kinderspitals Zürich - dies ist der einzige Ort in der Schweiz, an welchem diese Tests der Neugeborenen ausgewertet werden.
Der Test wurde 1965 in Zürich ein- und seither erfolgreich weitergeführt. Das Neugeborenen Screening wird jedoch erst seit 1974 landesdeckend durchgeführt. Seit 1965 wurden in der Schweiz und im Fürstentum Liechtenstein routinemässig 2'835'612 Babies auf PKU getestet, wobei 150 PKU-Kinder diagnostiziert wurden. Ich war damals im Februar 1983 das 63.Kind, bei welchem in der Schweiz PKU diagnostiziert wurde. In der Regel kommen drei bis vier PKU-Kinder pro Jahr auf die Welt. Die grosse Anzahl von Neugeborenen ist dafür verantwortlich, dass täglich, nebst den Diätkontrollen, durchschnittlich 120 Guthrie Tests ausgewertet werden.
Die Blutentnahme für den Test wird zwischen dem vierten und sechsten Lebenstag des Babys gemacht. Dabei werden durch einen Fersenstich vom Neugeborenen Bluttropfen auf die Guthrie-Karte (siehe Abb. 11) getropft und sorgfältig getrocknet.

Abb. 7: Blutentnahme bei einem Neugeborenen

Der Grund, weshalb man mit dem Guthrie Test vier bis sechs Tage warten muss, wird in der folgenden Zeichnung verdeutlicht:

Abb. 8: Aufzeichnung des Testzeitpunktes

Was passiert, wenn ein Test positiv ausfällt? Zuerst wird der zuständige Arzt benachrichtigt und es werden weitere Blutproben entnommen, um den Test zu wiederholen. In diesem Fall wird sogar eine venöse Blutentnahme durchgeführt. Anschliessend wird vom Arzt eine klinische Untersuchung durchgeführt, um weitere diagnostische Abklärungen zu treffen. Natürlich werden die Eltern benachrichtigt und über die therapeutischen Massnahmen informiert. Die Ernährung des Kindes wird sicherlich auch auf eine phenylalaninarme Diät umgestellt.

Blutentnahme

Bei meinem Besuch im Kinderspital Basel, wo ich den Test der Aminosäure-Bestimmung näher kennen lernen wollte, wurde mir Blut entnommen und anhand dieser Blutentnahme die Testart näher gebracht. Dabei dokumentierte ich die Blutentnahme photographisch.

Mit Eintauchen der Hand in heisses Wasser wird zuerst die Durchblutung der Finger gefördert. Anschliessend wird jener Finger, der zur Blutentnahme bestimmt ist, mit Alkohol desinfiziert.

Abb. 9: Reinigung des Fingers mit Alkohol

Danach wird mit einem Soft Click in den Finger gestochen.

Abb. 10: Fingerpick

Je nach Testart wird das Blut auf die Kreise der Guthriekarte getropft oder in kleine Röhrchen abgefüllt. Beim Guthrie Test ist wichtig, dass die Bluttropfen die Kreise auf der Karte ganz ausfüllen.

Über die beste Zeit zur Blutentnahme sind sich die Fachleute noch nicht ganz einig. Manche Betroffene machen den Test allerdings früh am Morgen, nüchtern. Dann besteht jedoch die Gefahr, dass der Körper schon begonnen hat vom eigenen Eiweiss abzubauen und das Resultat daher leicht verfälscht wird. Das Sinnvollste scheint, den Test etwa 4 Stunden nach dem Essen zu machen (am besten nach dem Mittagessen). Dabei muss beachtet werden, dass während den 4 Stunden zwischen der Mahlzeit und der Blutentnahme nichts gegessen wird, da dies das Resultat auch wieder verfälschen könnte.
Eine weitere Gefahr für die Verfälschung des Blutresultates besteht, wenn der Betroffene krank ist, sich nicht wohlfühlt oder auch Medikamente, wie z.B. Antibiotika, einnimmt.

Guthrie Test

Der Guthrie Test wurde von Herrn Robert Guthrie und Susi entwickelt. Erste Versuche des Testes wurden 1961 erstellt, doch erst im Jahre 1963 war der Test soweit entwickelt, dass er als Massenscreening und Kontrolle der PKU verwendet werden konnte. Dr. Robert Guthrie engagierte sich während über 30 Jahre seines Lebens für die PKU-Kinder. Der Guthrie Test ist ein Bakterienhemmtest und wird als semiquantitativ bezeichnet.

Bei diesem Testverfahren wird folgende Testkarte verwendet:

Abb. 11: Guthrie Testkarte, welche zum Neugeborenen Screening und zur Kontrolle der Diäteinhaltung verwendet wird. Der obere Teil (mit den Kreisen drauf) ist ein Filterpapier. In die Kreise wird das Blut getropft und getrocknet.

Wenn der Guthrie Test als Kontrolle verwendet wird, genügen eins bis zwei Bluttropfen, welche jedoch den Kreis ausfüllen sollten. Der Test sollte an der Luft getrocknet werden und schnellst möglich mit der Post ins Labor des zuständigen Spitals geschickt werden.

Im Labor wird die Blutkarte zuerst autoklaviert und anschliessend werden kleine Scheibchen aus der Karte ausgestanzt; dort wo sich der Bluttropfen befindet: (auf der Abb. ist nur eine leere Karte zu sehen, keine mit Bluttropfen, doch man sieht die Ausstanzung trotzdem am richtigen Ort)

Abb. 12: Ausstanzen der Guthriekarte

Diese kleinen ausgestanzten Scheibchen werden in Reih und Glied auf eine schon zubereitete Agarplatte gelegt, wobei in der Mitte eine Reihe von Standardscheibchen angelegt wird. Diese haben die Funktion die Phe-Werte von 100–1200mmol/L aufzuzeigen.
Die Agar-Lösung wird aus verschiedenen Stoffen hergestellt, die wichtigsten jedoch sind b-2-Thienylalanin und Bacillus subtilis Sporensuspension. Die Bacillus subtilis Sporensuspension ist dafür zuständig, dass das Phenylalanin auf der Nährplatte die Bakterien keimen lässt. Das b-2-Thienylalanin ist ein so genannter Inhibitor und wirkt, bei Phe-Werten unter 100mmol/L, auf die Bakterien als hemmende Substanz.

Die Scheibchen werden über Nacht auf der Agarplatte bei 36°C im Brutkasten, wo ideale Wachstumsvoraussetzungen für Bakterien gelten, aufbewahrt. Danach können die verschieden grossen Wachstumszonen mit dem Zirkel ausgemessen und anhand der Phe Standart Scheibchen können die Werte bestimmt werden.

Abb. 13: Agar Platte

Falls eines der Neugeborenen PKU hat, fällt es ganz klar durch einen grossen Hof um das Scheibchen auf. Auf dieser Platte ist kein PKU Neugeborenes zu finden. Die Diätkontrollen sind jeweils auf dem unteren Teil der Platte angesetzt, welche durch die Standart Scheibchen von denen der Neugeborenen getrennt wird.
Die Standart Scheibchen werden mit normalem Blut vom Blutspendezentrum SRK und einer Beigabe von Phe zusammengemischt. Die Konzentrationen werden jeweils ins Aminosäurenlabor zur quantitativen Phe Bestimmung gegeben. Nach dieser Überprüfung werden die Standartproben auf Filterpapier getropft, getrocknet und bei -20°C aufbewahrt.

Amino-Acid-Quantity (=quantitative Aminosäure-Bestimmung)

Die PKU-Betroffenen, welche den Aminosäure-Bestimmungstest machen, müssen ihr Blut in kleine Röhrchen füllen und diese ins Labor schicken. Diese Röhrchen, die Mikroproben, sind mit einem Stoff beschichtet, welcher dafür verantwortlich ist, dass das Blut nicht gerinnt.

Abb. 14: Blut in Röhrchen einfüllen

Die im Labor angekommen Mikroproben werden zweimal mit 10'000 Touren je drei Minuten lang zentrifugiert.

Abb. 15: Zentrifuge

Abb. 16: Zentrifugierte Probe, die oben das Plasma hat und unten die roten Blutkörperchen.

Im Plasma befinden sich die gesuchten Aminosäuren. Danach wird das Plasma zum so genannten „Enteiweissen“ in Eppendorfröhrchen gegeben. Bevor das Gemisch in den Kühler gestellt wird, muss 10% Sufosalicylsäure beigegeben werden. Dies entspricht dem Verhältnis von 1:3 zur Plasmamenge.

Abb. 17: Abfüllen des Plasmas in Eppendorfröhrchen

Abb. 18: Plasma und Säure vor dem Vermischen
Abb. 19: Nach dem Zusammenmischen ist eine milchige Flüssigkeit entstanden.

Nach 30 Minuten nimmt man das Röhrchen wieder aus dem Kühler und zentrifugiert das Ganze nochmals. Dabei sinken die Proteine ab und eine klare Flüssigkeit schwimmt oben auf. Diese klare Flüssigkeit, der so genannte Überstand, ist das Blutplasma, wo die Aminosäuren vorhanden sind.
Dieser Überstand wird in ein neues Gefäss abpipetiert. Das neu verwendete Gefäss heisst Vial. Zu dem Überstand wird im Verhältnis 1:1 ein interner Standart beigefügt. Dieser Standart enthält einen Wert von Aminosäuren, welcher dem Auswertungsgerät bekannt sind. Zusammengesetzt ist der Standart aus Glucosaminicacid und Amino-Ethyl-Cystein.

Abb. 20: Abpipetieren von Überstand
Abb. 21: Einfüllen in Vial

Nun muss das Vial nur noch geschüttelt werden, um die Flüssigkeiten zu vermischen und dann ist es bereit für den Apparat. Dieser muss zuerst einen Spülgang durchlaufen, denn die Nadel, welche von der Probe aus dem Vial die Flüssigkeit entnimmt, ist noch nicht sauber.

Abb. 22: Amino Acid Analyser

Der Amino Acid Analyser braucht 150 Minuten bis er ein Resultat der Probe hat. Schlussendlich wird ein Diagramm ausgedruckt, welches alle Werte der Aminosäuren anzeigt.

Abb. 23: Diagramm des Amino Acid Anaylser

Der Computer liefert exakte Werte, solche, die sogar auf die Kommastelle genau sind! Zudem ist auch ersichtlich, ob die anderen Aminosäuren genügend vorhanden sind, das heisst, ob genügend Aminosäuremischung eingenommen wird.
Diese Testart läuft unter der Bezeichnung quantitativer Test und ist demnach nicht nur semiquantitativ, wie der Guthrie Test. 
Die Aminosäure-Bestimmung wird anhand einer so genannten Säulechromatographie gemacht. Bei dieser Art von Chromatographie sind die stationären Phasen innerhalb von Glasrohren, als so genannte Säulen. Diese können von mobilen Phasen in der Längsrichtung durchflossen werden. 
Die Aminosäuren brauchen verschieden lang, um ausgewertet zu werden. (siehe Diagramm).

Andere Testarten

Fluorimetrie: Diese Methode ist eine der quantitativen Bestimmungsarten. Bei dem Vorgang reagiert Phenylalanin mit Kupfer und Ninhydrin zu einer Verbindung. Es können auch andere Aminosäuren anhand von dieser Testart bestimmt werden, wie zum Beispiel Tyrosin, Tryptophan, Leuzin oder Arginin, welche bei der Entstehung der Verbindung mitreagieren, doch die Mitbeteiligung dieser Aminosäuren wird unter 5% geschätzt.

Dünnschichtchromatographie: Dies ist ein Test, welcher sich besonders für die Früherkennung der PKU als geeignet erwiesen hat. Mit dieser Chromatographie hat man nicht nur die Möglichkeit die PKU sondern auch andere Aminosäure-Stoffwechselkrankheiten früh zu erkennen,. Der Nachteil dieser Testart ist, dass man das Serum für die Durchführung des Testes benötigt. Diese Methode ist wie der Guthrietest eine semiquantitative Bestimmungsart. Als Merkmal hat sie folgendes: Die stationäre Phase ist in Form einer dünnen Schicht auf Kunststofffolien oder Glasplatten aufgezogen.

Papierchromatographie: Diese Testart ist eine semiquantitative Methode. Man trägt die (Blut-) Probe in einem Punkt auf das Papier auf. Dieses wird dann in einen mit Lösungsmittel gefüllten Trog getaucht. Das Papier saugt das Lösungsmittel in sich auf und wandert, durch Kapillarkräfte ausgelöst, vom einen Papierrand zum anderen. Die verschiedenen Bestandteile der Probe werden durch das Lösungsmittel unterschiedlich weit mitgenommen. Anschliessend wird das Papier getrocknet. Um 90° gedreht, gibt man das Papier nach der Trocknung in ein weiteres Lösungsmittel, damit sich noch mehr Bestandteile von einander trennen. Schlussendlich werden die Substanzen mittels Wanderungsgeschwindigkeiten in den verschiedenen Lösungsmitteln identifiziert. (Vgl. Abb. 24)

Abb. 24: Papierchromatographie

Hochdrucksflüssigkeitschromatographie (quantitativ): Dies ist die heute am meisten eingesetzte Variante der Säulenchromatographie. Diese Chromatographie führt zu besonders hochauflösenden und schnellen Trennungen der Probenbestandteilen, da sie mit speziell fein verteilten stationären Phasen arbeitet. Das ganze Vorgehen wird, wie es der Name schon sagt, durch erhöhten Druck beschleunigt bzw. verkürzt. Die Druckerhöhung kann bis zu 300 bar sein.

Ionenaustauschchromatographie: Hier handelt es sich um ein quantitatives Verfahren, bei welchem mit dem Trägerstoff ein Austausch der Kationen oder der Anionen in der Lösung statt-findet. Dies ist ein wichtiges Verfahren, um Stoffe wie Aminosäuren, Nucleinsäuren, Nucleotide, Proteine, Peptide usw. zu charakterisieren oder ionische Verbindungen zu isolieren. Man kann die Ionenaustauschchromatographie als Dünnschicht- oder Säulenchromatographie einsetzen.

Kalorimetrie: Über die Existenz dieser Testart erfuhr ich durch eine Antwort auf meine Umfrage. Leider konnte ich durch die Person, welche diese Methode in dem Fragebogen angab, nicht mehr Informationen bekommen.
Dank der Biologie Lexika kann ich jedoch folgendes über die Kalorimetrie sagen:
Durch einen so genannten Kalorimeter können anhand Messungen von Wärmemengen beispielsweise Angaben über den Kaloriengehalt von Lebensmitteln, Wärmetönung chemischer Vorgänge oder die spezifische Wärme von Stoffen gemacht werden. In der Tierphysiologie wird die Bestimmung der umgesetzten Energie und damit auch die der Stoffwechselintensität anhand des Kalorimeters gemacht.

Pandemassen-Spektrometer: Von dieser Testart hatte ich bisher noch nichts gehört, doch sie war in einer Umfrage als verwendete Methode vermerkt. Ich versuchte über die Person, welche mir diese Umfrage ausfüllte mehr Informationen zu bekommen, da meine Suche bis anhin erfolglos blieb. Leider konnte ich bis heute nicht viel mehr darüber herausfinden. Ich weiss jedoch, dass ein Spektrometer ein Gerät ist, welches die Absorption von bestimmten Wellenlängen des zu überprüfenden Stoffes misst. Oft wird das Spektrometer für die Bestimmung von Gasteilchen verwendet. Das Pandemassen-Spektrometer wird wohl eine Art von Spektrometer sein, mit dem man bestimmte Blut-Werte überprüfen kann.

Hinweis auf Umfrage und Versuche

Um in meiner Arbeit anhand von Daten über PKU-Kinder und -Erwachsene auch selbst etwas herauszufinden, habe ich eine Umfrage gestartet. In der Schweiz verschickte ich meine Fragebogen an 94 verschiedene PKU-Betroffene. Da es mir am Herzen lag, möglichst viele Informationen zu sammeln, sandte ich die Umfrage auch an eine Amerikanische Mailinglist sowie an die der ESPKU.
Eigentlich war es mein Ziel, die Umfrage auch nach Deutschland und Neuseeland zu bringen, doch kamen verschiedene Probleme dazwischen. In Neuseeland wollte man mir zuerst die Adressen der PKU-Familien aus Gründen des Datenschutzes nicht geben und anschliessend wurde von der neuseeländischen Ernährungsberaterin entschieden, dass meine Umfrage von neuseeländischen Familien anscheinend nicht ausgefüllt werden könne! Bis auf Deutschland hat es mein Fragebogen nicht geschafft, weil die Deutsche PKU Homepage etwa seit August 2002 im Umbau ist und ich meine Umfrage dadurch nicht dorthin schicken konnte. Für einige Zeit waren meine Frageblätter jedoch auf der österreichischen Homepage zu finden.

Versuch: Blutwerte bei verschieden genauer Diätführung
Bei dem ersten Versuchsteil nahm ich mir 10 Tage lang, jeweils 4 Stunden nach dem Mittagessen, Blut, um die Phe-Konzentration zu testen. Während dieser Zeit führte ich meine Diät gewohnheitsgemäss. Das heisst, ich wog nicht mehr alle Esswaren ab, da mir viele Mengen und Gewichte der Nahrungsmittel „im Gefühl“ sind. Ich berechnete zwar immer was ich ass, doch nicht haargenau.
Im zweiten Versuchsteil machte ich eine viel genauere Diät und wog jedes Nahrungsmittel, welches ich ass, genaustens ab.
Ich entnahm immer 4 Stunden nach dem Mittagessen das Blut, damit der Körper immer gleich viel Zeit hatte, das Phe zu verarbeiten.

Versuch: Blutwerte über einen Tag hinweg
Bei diesem Experiment wollte ich herausfinden, wie sich die Phe-Konzentration im Blut während eines Tages verändert. Zu diesem Zweck nahm ich an zwei verschiedenen Tagen alle 45 Minuten Blut.
An einem Tag ass ich alle eineinhalb Stunden gleich viel Eiweiss. Der Hintergedanke war, zu sehen, ob und wie gut sich der Phe-Wert im Blut konstant halten lässt.
Am zweiten Tag nahm ich drei Mahlzeiten zu mir. Hier war es mein Ziel die Schwankungen des Phe-Spiegels faktisch darzulegen und zu sehen wie gross die Schwankungen tatsächlich sind.

Versuch: Testresultate im Vergleich
Schon seit längerer Zeit nimmt es mich Wunder, wie verschieden die Resultate herauskommen, wenn ich zur gleichen Zeit für den Guthrie Test und die Aminosäure-Bestimmung Blut entnehme. Dies tat ich in diesem Versuch und wartete gespannt auf die Resultate!